ПЕПТИДНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ РЕПАРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ В ОРГАНАХ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ УСКОРЕННОМ СТАРЕНИИ
В.Х. Хавинсон, Н.С. Линькова
ИМ. Цветной, ВО. Полякова
Д.В. Трофимов, Н.Н. Севостьянова Р.И. Абдулрагимов
Санкт-Петербургский институт биорегуляции и Геронтологии,
СЗОРАМН
Проведено исследование влияния пептида Т-38 на процессы пострадиационного восстановления ключевых органов иммунной системы - тимуса и селезенки крыс в модели ускоренного старения. Показано, что иммуногеро- протекторный эффект пептида Т-38 выражался в восста новлении структуры сосудистого русла иммунных органов и усилении пролиферативной активности клеток тимуса и селезенки.
Ключевые слова: тимус, селезенка, ускоренное ста рение, пролиферация, пептиды.
Основной задачей современной иммунобиогеронтологии является изучение ме- ханимзов старения важнейших органов иммунной системы - тимуса и селезенки, а так же поиск путей коррекции возрастной инволюции указанных органов [5]. Известно, что старение тимуса начинается с момента полового созревания, а в пожилом и старче ском возрасте его функциональная активность резко снижается [1]. Возрастная атро фия тимуса приводит к снижению иммунологической активности селезенки, что про является в снижении Т-хелперной активности [2]. Многолетний опыт применения ко ротких пептидов в терапии стресс-индуцированных иммунодефицитов, преждевре менного старения и возрастной патологии показал, что пептидергическая регуляция гомеостаза организма может являться одним из перспективных направлений практи ческой геронтологии и гериатрии [3-4, 6-7]. В связи с этим представляется важным ис следование репаративной способности тимуса и селезенки в модели ускоренного ста рения под действием пептидов.
Материалы и методы исследования Исследования выполнены на 20 самцах крыс линии Вистар в возрасте 2,5 месяцев с массой тела 140-150 г. Животные были раз делены на 4 группы: 1 группа - контроль, 2 группа - уоблучение, 3 группа - y~ облучение с последующим введением контрольного пептида Т-34 (H-Glu-Asp-Gly-OH, хонлутен) в дозе 20 нг/ мл и 4 группа - у-облучение с последующим введением опытно го пептида Т-38 (H-Lys-Glu-Asp-OH, везуген) в дозе 20 нг/ мл.
Общее однократное облучение животных 2, 3 и 4 групп в дозе 7 Гр. выполнено на кобальтовом аппарате ЛУЧ при мощности 32 сГр/мин.
В качестве опытного пептида был выбран Т-38, поскольку он оказывает влияние на сосудистую систему, которая наиболее подвержена радиационному старению. В ка честве контрольного (сравнительного) пептида был выбран Т-34, имеющий сродство к дыхательной системе и не влияющий на сосудистый компонент. Исследуемые пептиды вводили животным внутрибрюшинно через 2 часа после облучения по 0,5 мкг в тече ние 5 дней. Крысам 1 группы по той же схеме вводили физраствор. Выделение тимуса и селезенки проведено под нембуталовым наркозом в дозе 50 мг/кг на 7 сутки после об лучения.
Кусочки тимуса и селезенки объемом 1 см3фиксировали и обезвоживали, а за тем заключали в парафин. Срезы толщиной 3-5 мкм помещали на предметные стекла и окрашивали гематоксилином и эозином.
Изучение пролиферативной активности тканей тимуса и селезенки крыс ме тодом иммуногистохимии проводили с применением мышиных моноклональных антител к маркеру пролиферации клеток PCNA (1:50, Dako) согласно стандартному протоколу.
Морфометрическую оценку данных выполняли на микроскопе Olimpus СХ41 с цифровой камерой Nikon Coolpix 4500 с помощью системы анализа микроскопических изображений Analysis 5.0. Индекс пролиферации PCNA рассчитывали в процентах как отношение количественной плотности иммуноокрашеных ядер к количественной плотности ядер клеток, окрашенных гематоксилином. Статистическая обработка ре зультатов выполнялась в программе Statistica 6,0.
Результаты исследования В 1 группе (контроль): внешний вид и внут ренние органы животных соответствовали норме. Весовой диапазон для селезенки со ставил 570-870 мг, для тимуса - 400-550 мг.
Тимус. На гистологических срезах тимус интактных крыс имел дольчатое строение. В дольках отчетливо различалось более темное, расположенное снаружи корковое вещество и более светлое центрально расположенное мозговое вещество (рис. lA). Основная популяция пролиферирующих клеток в тимусе интактных живот ных по индексу PCNA составила 23,6 ± 1,4% (рис. 3) и располагалась в слое коркового вещества с тенденцией концентрироваться в периферической зоне долек.
Селезенка. У крыс контрольной группы гистологический рисунок селезенки со ответствовал вариантам нормы (рис. 2А). Соединительно-тканная капсула органа была относительно тонкой и содержала многочисленные коллагеновые волокна.
Белая пульпа была представлена совокупностью лимфоидных периартериаль- ных муфт и фолликулов округлой формы. В центрах размножения фолликулов выяв лялись делящиеся клетки и отдельные лимфоциты, погибающие путем апоптоза. Красная пульпа состояла из тяжей и венозных синусов, заполненных форменными элементами крови. В субкапсулярной зоне красной пульпы и вдоль трабекул распола гались небольшие очаги экстрамедуллярного кроветворения.
На препаратах, иммуноокрашенных на PCNA, пролиферирующие клетки были сконцентрированы, в основном, в центрах размножения лимфоидных фолликулов и зонах гемопоэза, где индекс пролиферативной активности составил 35,4±1,о% (рис. 4).
У облученных животных (2 группа) внутренние органы были умеренно ане мичны, мезентериальные лимфоузлы имели темный цвет. Тимус и селезенка были умень шены в размерах. Масса селезенки варьировала от 220 до 400 мг, тимуса - от 90 до 140 мг.
Тимус. На гистологических срезах размеры долек были значительно уменьше ны. Деление на корковое и мозговое вещество стиралось, а в некоторых дольках исче зала граница между слоями (рис. 1Б). Похожие инволютивные изменения выявляются и при естественном старении тимуса у лиц старше 6о лет. Клеточность коркового ве щества снижалась, однако пролиферативная активность тимоцитов по индексу PCNA возрастала по сравнению с контролем (рис. 3), что свидетельствует о пострадиацион ном восстановлении ткани тимуса.
В мозговом веществе деструктивные изменения были менее выражены. Соот ношение между паренхимой и стромой нарушалось в сторону увеличения последней. Отмечался отек сосудов соединительно-тканных перегородок. Строма была набухшая, отечная, с жировой инфильтрацией по периферии долек.
Селезенка. После облучения в ткани селезенки отмечалось сокращение белой пульпы и атрофия периартериальных муфт. На месте лимфоидных фолликулов были видны центральные артерии, окруженные узким ободком перифолликулярной рети кулярной ткани, в которой можно было обнаружить единичные скопления распадаю щихся лимфоцитов, плазматических и ретикулярных клеток (рис. 2В). Стенки крове носных сосудов белой пульпы и соединительно-тканных трабекул были отечными и частично гомогенизированными за счет плазматического пропитывания. Перифери ческие синусы в селезенке переполнялись кровью, а строма в субкапсулярной зоне бы ла практически оголена. Клеточность в субкапсулярной зоне снижалась более чем в 2 раза, однако по периферии селезенки пролиферативная активность клеток по PCNA возрастала до 58,з±з,о% (рис. 4).
У облученных животных на фоне введения пептида Т-34 (3 группа) в тимусе и селезенке отмечались деструктивные изменения, характерные для тех, ко торые были описаны во 2 группе. Однако, индекс пролиферативной активности в тка нях обоих исследуемых иммунных органов снижался по сравнению со 2 группой (рис. з, 4). Полученные данные свидетельствуют, что контрольный пептид Т-34, не об ладающий тканеспецифичностью к иммунным клеткам и сосудистой системе, не ока зывает репаративного эффекта в модели ускоренного старения тимуса и селезенки.
У облученных животных на фоне введения пептида Т-38 (4 группа)
ткани тимуса и селезенки не имели признаков анемии, характерных для животных 2 и 3 групп.
Тимус. Пострадиационное введение пептида Т-38 способствовало восстановле нию дифференциации долек тимуса на корковое и мозговое вещество (рис. lB). По пе риферии коркового вещества наряду с увеличением клеточности появлялись крупные лимфобласты. В мозговом веществе были видны скопления крупных клеток, форми рующих эпителиальную сеть. Кровеносные капилляры были сужены, без выраженных признаков периваскулярного отека.
PCNA+ клетки верифицировались по всей площади коркового вещества. Индекс пролиферативной активности возрастал почти на 50% относительно контроля и был выше, чем в других исследуемых группах (рис. 3).
Селезенка. Под действием пептида Т-38 после облучения в селезенке опреде лялось относительное увеличение содержания белой пульпы и появление крупных ге- мопоэтических островков. В лимфатических фолликулах и парафолликулярной зоне повышалось содержание крупных лимфобластов, многие из которых находились в со стоянии митотического деления, что косвенно предполагает активацию процессов ре- паративной регенерации в селезенке (рис. 2В). Группы PCNA+ клеток были верифици рованы по всей паренхиме селезенки, причем в зонах гемопоэза они формировали об ширные скопления. Индекс PCNA имел тенденцию к повышению по сравнению с группой облученных животных и достоверно возрастал по сравнению с контролем (рис. 4).
Заключение. Облучение вызывает ряд патологических процессов в тимусе и селезенке, которые на уровне органов выражаются в снижении их массы, а на уровне тканей проявляются в деструкции сосудистого русла, отеке, снижении клеточности иммунных органов. Все перечисленные изменения на органном и тканевом уровнях сходны с проявлениями естественной инволюции иммунной системы при старении.
Эффекты пептидов в модели ускоренного старения определяются их тканеспе- цифичностью. Так, пептид Т-34, тропный к тканям дыхательной системы, не влиял на состояние облученных тканей, а в некоторых случаях даже способствовал замедлению их восстановления. Однако под действием пептида Т-38, эффекты которого направле ны на сосудистое русло, наблюдалась репарация тканей тимуса и селезенки и усиление пролиферативной активности иммунных клеток в них, при этом патология сосудистого русла, индуцированная облучением, полностью отсутствовала.
Полученные данные показали, что пептид Т-38, воздействуя на сосудистый компонент, восстанавливает структуру и функциональную активность органов иммун ной системы при их ускоренном старении, что позволяет рекомендовать его в качестве геропротекторного средства при развитии иммунодефицитных состояний.
Литература
1. Кветной, И.М. Нейроиммуноэндокринные механизмы регуляции пролиферативной ак тивности тимоцитов в постнатальном онтогенезе / И.М. Кветной и др. // Мед. акад. журнал. - 2004. - Т. 47. - No 4. - С. 52-58.
2. Полякова В.О. Тимус и старение / В.О. Полякова и др. // Успехи геронтол. - 2001. - Вып. 8. - С. 50-57-
3. Хавинсон, В.Х. Пептидная регуляция старения/ В.Х. Хавинсон. - СПб.: Наука, 2009. - 50 с.
4. Хавинсон, В.Х. Пептидная регуляция старения: 35-летний опыт исследований / В.Х.Хавинсон, В.Н. Анисимов // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2009. - Т. 148. - No 7. - С. 108-113.
5. Хавинсон, В.Х. Пептидная регуляция иммунобиологических механизмов старения / В.Х. Хавинсон, В.В. Малинин // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9. - No 4. - С. 443-444. 6. Хавинсон, В.Х. Пептиды эпифиза и тимуса в регуляции старения/ В.Х. Хавинсон,
В.Г. Морозов. - СПб.: Фолиант, 2001. - 160 с.
7. Anisimov, V.N. Peptide bioregulation of aging: results and prospects / V.N. Anisimov, V.Kh.
Khavinson // Biogerontology. - 2010. - Vol. 11. - P. 139-149.
Вход
Регистрация
Наверх
